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Durchflusszytometrie

Labore und ein paar Hinweise zur Durchführung einer spezifischen Durchflusszytometrie bei Verdacht einer PNH1,2-5

Die Entscheidung, welche Patient:innen auf Paroxysmale Nächtliche Hämoglobinurie (PNH) getestet werden sollten, ist ein kritischer Schritt in der Diagnosestellung.

Hier sind einige Schlüsselindikatoren, die eine Testung auf PNH rechtfertigen:

  1. Ungeklärte Hämolytische Anämie: Patient:innen mit Anzeichen einer Hämolyse, wie erhöhtes Laktatdehydrogenase (LDH), niedriges Haptoglobin und erhöhte indirekte Bilirubinwerte, insbesondere wenn diese Anämie durch Standardtherapien nicht verbessert wird. Auch Patient:innen mit unklarer Eisenmangelanämie nach sorgfältigem Ausschluss anderer Erklärungen.
  2. Thrombotische Ereignisse: Ungewöhnliche venöse Thrombosen, insbesondere in atypischen Lokalisationen wie den hepatischen, mesenterischen oder zerebralen Venen, können auf PNH hinweisen.
  3. Symptome der Hämoglobinurie: Patient:innen, die eine Dunkelfärbung des Urins, insbesondere am Morgen, berichten, sollten auf PNH untersucht werden.
  4. Wiederkehrende abdominelle Schmerzanfälle unbekannter Ursache oder Schluckbeschwerden, besonders in Verbindung mit Anzeichen einer Hämolyse.
  5. Knochenmarkversagen-Syndrome: Patient:innen mit Zuständen wie aplastischer Anämie oder Myelodysplastischem Syndrom haben ein erhöhtes Risiko für PNH und sollten entsprechend untersucht werden.
  6. Ungeklärte Zytopenie: Patient:innen mit unerklärter Anämie, Leukopenie oder Thrombozytopenie könnten von einer PNH-Testung profitieren.
  7. Fehlen von Autoimmunmarkern: Bei Patient:innen mit hämolytischer Anämie, aber negativen Coombs-Tests, sollte eine PNH-Testung in Betracht gezogen werden.

Die frühzeitige Identifizierung von Patient:innen, die möglicherweise an PNH leiden, ist entscheidend für eine zeitnahe und angemessene Behandlung. Die Durchflusszytometrie spielt dabei eine zentrale Rolle.

Zum Verständnis der PNH:

Paroxysmale Nächtliche Hämoglobinurie (PNH) ist eine seltene, erworbene Erkrankung des blutbildenden Systems, die durch die Zerstörung roter Blutkörperchen gekennzeichnet ist. PNH entsteht durch einen Defekt in den Stammzellen des Knochenmarks, der zu einer erhöhten Empfindlichkeit der roten Blutkörperchen gegenüber dem Komplementsystem führt. Klinisch manifestiert sich die PNH durch Symptome wie Hämolyse, Müdigkeit, Thrombosen und Anämie.

Die Durchflusszytometrie ist ein unverzichtbares Werkzeug in der Diagnostik der PNH. Sie ermöglicht die quantitative Analyse von Zelloberflächenmarkern, die bei PNH-Patient:innen verändert sind. Die Differentialdiagnose der PNH umfasst andere Ursachen der Hämolyse und Knochenmarkversagen-Syndrome. Hierbei ist die Durchflusszytometrie entscheidend, um PNH von ähnlichen Erkrankungen wie Autoimmunhämolytischen Anämien oder Myelodysplastischen Syndromen zu unterscheiden.

Durchführung der Testung:

Analyse:

Die durchflusszytometrische Analyse sollte von einem erfahrenen Labor durchgeführt werden, das mit der Interpretation der spezifischen Muster der PNH vertraut ist. CD55 und CD59 auf Erythrozyten und Leukozyten: Der Verlust dieser Marker ist charakteristisch für PNH. Die Durchflusszytometrie kann den Anteil der Zellen ohne diese Marker präzise bestimmen. Bei Verdacht auf PNH sollte eine frühzeitige Überweisung an ein spezialisiertes Labor erfolgen.

  • Material: Verwendung von peripherem Blut, bevorzugt EDTA-antikoaguliert. Für die Routine-Diagnostik sollte Knochenmark nicht untersucht werden, da die Interpretation aufgrund physiologischer Veränderungen der Expression GPI-verankerter Proteine im Rahmen der hämatopoietischen Differenzierung sehr schwierig ist.
  • Intervall zwischen Entnahme und Untersuchung: Die Untersuchung sollte möglichst innerhalb von 48 Stunden, maximal jedoch innerhalb von 72 Stunden nach der Entnahme erfolgen. Bei Transportzeiten über 24 Stunden ist eine Kühlung der Probe (zwischen +1 und +10°C) empfehlenswert.
  • Untersuchte Zellreihen: Beispielsweise Granulozyten und Retikulozyten. Für jede Zellreihe sollten mindestens zwei verschiedene Marker (GPI-verankerte Proteine oder GPI-Anker selbst) untersucht werden. Die untersuchte Zellpopulation sollte mit einem nicht-GPI-verankerten Marker identifiziert werden.
  • Befund: Der Befund sollte quantitative Angaben für die untersuchten Zellreihen enthalten, mit getrennter Angabe des Anteils von Zellen (PNH-Klongröße) mit völlig fehlender Expression GPI-verankerter Proteine (PNH-Typ III-Zellen) und reduzierter Expression (PNH-Typ II-Zellen).
  • Sensitivität: Bei Routineuntersuchungen sollte ein Nachweis einer GPI-defizienten Population ab einem relativen Anteil von 1% möglich sein. Bei der Untersuchung von Patient:innen mit aplastischer Anämie könnte eine Herabsetzung der Sensitivitätsgrenze auf 0,001% in Betracht gezogen werden.

Planung von Verlaufskontrollen:

  • Regelmäßige Überwachung unter Komplement-Inhibitions-Therapie: Durchführung der durchflusszytometrischen Analyse alle 3 bis 6 Monate.
  • Verlaufskontrolle bei signifikanter GPI-defizienter Population: Anfängliche halbjährliche Analysen, wie in dieser Quelle empfohlen.
  • Übergang zu jährlichen Untersuchungen bei stabilem Krankheitsverlauf.
  • Anpassung der Untersuchungsintervalle bei variabler klinischer Symptomatik oder Schwankungen im GPI-defizienten Zellanteil:
  • Individuelle Anpassung der Untersuchungsintervalle, um auf Veränderungen im Krankheitsverlauf reagieren zu können.
  • Spezielle Überwachung nach allogener Transplantation: Durchführung der Analyse alle drei Monate bei positivem Empfängeranteil in der Chimärismusanalyse, bis keine GPI-defiziente Population mehr nachweisbar ist. Erneute Analyse bei Verdacht auf ein Rezidiv nach der Transplantation.
  • Routinemäßige Kontrollen nach Diagnose einer aplastischen Anämie: Jährliche Wiederholung der Analyse, sofern keine Anzeichen einer signifikanten Hämolyse bestehen.

Diese strukturierten Richtlinien sollen eine effiziente und zielgerichtete Überwachung des Krankheitsverlaufs ermöglichen und sind an die spezifischen Bedürfnisse und Veränderungen im Zustand des Patient:innen anzupassen.

Die Durchflusszytometrie ist somit ein unverzichtbares Instrument in der Diagnostik der PNH. Eine genaue Diagnose ermöglicht eine gezielte Behandlung und verbessert die Prognose für Patient:innen mit dieser komplexen Erkrankung.

Haben Sie noch Fragen zur Durchführung einer PNH Durchflusszytometrie? Wollen Sie mit Ihrem Labor auch hier geführt werden? Dazu kontaktieren Sie bitte unseren Ansprechpartner für Labordiagnostik Dr. D. Dedes unter dimitrios.dedes@alexion.com


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Bearbeitungszeit (Tage) Hoch-
sensitivitäts-
analyse
Retikulozyten
Hämatologisches Speziallabor,
Innere Med. I, Uniklinik Homburg
66421 Homburg

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-
Bearbeitungszeit (Tage)
2
Hoch-
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Ja
Retikulozyten
Nein
IMD Institut für Medizinische Diagnostik
Berlin-Potsdam GbR
12247 Berlin

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Die Probe (EDTA-Blut) sollte innerhalb von 24 Stunden im Labor sein.
Bearbeitungszeit (Tage)
3
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Ja
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Institut für Hämatopathologie Hamburg
22547 Hamburg

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Material: EDTA-Blut. Zeitraum zwischen Probenentnahme und Messung max. 48 Stunden.
Hochsensitivitätsanalyse (Klongrösse <1%) ist möglich bei sehr guter Materialqualität.
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4
Hoch-
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Ja
Retikulozyten
Nein
Labor Berlin, Hämatologie/ Onkologie
13353 Berlin

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Probeneingang Montag-Freitag,
Freitags bis 12.00 Uhr 
Bearbeitungszeit (Tage)
2
Hoch-
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Nein
Retikulozyten
Ja
Labor für Durchflusszytometrie Institut Dessau DRK Blutspendedienst NSTOB
06847 Dessau-Roßlau

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Bitte um Einsendung von 5 ml EDTA-Blut.
Knochenmarkblut ist ungeeignet. 
Bearbeitungszeit (Tage)
2
Hoch-
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Ja
Retikulozyten
Ja
Labor für Hämatologie Mannheim
68161 Mannheim

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-
Bearbeitungszeit (Tage)
7
Hoch-
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Retikulozyten
Ja
Labor München Zentrum
80339 München

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Einsendung Mo-Do
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Ja
Retikulozyten
Nein
Medizinische Hochschule Hannover
30625 Hannover

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Hämostaseologische Beratung in Notfall-Situationen (24 / 7):
0178 - 402 49 62
Annahme Mo-So 6-20 Uhr und Erledigung am folgenden Werktag
Bearbeitungszeit (Tage)
1
Hoch-
sensitivitäts-
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Ja
Retikulozyten
Nein
Medizinisches Zentrallabor/
IDCL Klinikum "St. Georg Leipzig"
04109 Leipzig

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EDTA-Blutprobe (mind. 1ml) mit ÜN-Kurier (innerhalb von 24 h
nach BE) versenden. Telefonische Anmeldung erwünscht. 
Bearbeitungszeit (Tage)
2
Hoch-
sensitivitäts-
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Ja
Retikulozyten
Nein
MLL Münchner Leukämielabor
81377 München

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Probenannahmen und Analyse montags bis samstags
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1
Hoch-
sensitivitäts-
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Ja
Retikulozyten
Nein
MVZ Coagumed GmbH
10789 Berlin

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-
Bearbeitungszeit (Tage)
5
Hoch-
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Nein
Retikulozyten
Ja
MVZ Labor PD Dr. Volkmann und Kollegen GbR
76131 Karlsruhe

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Material: EDTA-Vollblut, Analyse Montag bis Samstag,
bei Probeneingang bis 10 Uhr Befund am selben Tag.
Bearbeitungszeit (Tage)
1
Hoch-
sensitivitäts-
analyse
Ja
Retikulozyten
Ja
SYNLAB MVZ
Hämatologisches Labor Köln
50937 Köln

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-
Bearbeitungszeit (Tage)
2
Hoch-
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Ja
Retikulozyten
Ja
Uniklinik RWTH Aachen
Labor für Hämatologische Spezialdiagnostik

52074 Aachen

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Messergebnis ist nach Probeneingang typischerweise am gleichen Tag vor- handen. Befundversendung dauert wegen Arztbriefschreibung eher 3 Tage. Grundsätzlich bei Einsendung Transfusionshistorie und klinische Angaben sinnvoll.
Bearbeitungszeit (Tage)
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Hoch-
sensitivitäts-
analyse
Nein
Retikulozyten
Ja
Uniklinikum Bonn Institut für Exp. Hämatologie und Transfusionsmedizin
53127 Bonn

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Material: EDTA; Entsprechend der aktuellen Leitlinien sollen die Proben spätestens 24 h nach Entnahme gekühlt (versendet) werden.
Die Analyse der WBC erfolgt innerhalb 48h (max. 72 h) nach Blutentnahme, die Analyse der RBC >innerhalb längestens 7 Tagen.
Bearbeitungszeit (Tage)
3
Hoch-
sensitivitäts-
analyse
Ja
Retikulozyten
Nein
Uniklinikum der TU Dresden, Medizinische Klinik 1, Labor MK1-L06, Haus 31, Raum 216
01309 Dresden

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Material (EDTA-Monovette) bitte möglichst bis 12 Uhr am Abnahmetag einsenden.
Bearbeitungszeit (Tage)
1
Hoch-
sensitivitäts-
analyse
Ja
Retikulozyten
Ja

referenzen

Literatur und aktuelle Leitlinien der Flow Cytometry ICCS 2018:

  1. Schubert J, Bettelheim B, Brümmendorf TH, Höchsmann B, Panse J, Röth A, Schrezenmeier H, Stüssi G, Onkopedia Leitlinien. Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH). Stand Juni2023. Verfügbar unter:
    https://www.onkopedia.com/de/onkopedia/guidelines/paroxysmale-naechtliche-haemoglobinurie-pnh/@@guideline/html/index.html. Abgerufen im November 2023.
  2. Dezern AE, Borowitz MJ. ICCS/ESCCA consensus guidelines to detect GPI-deficient cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and related disorders part 1 – clinical utility. Cytometry B Clin Cytom 2018; 94: 16-22.
  3. Sutherland DR et al. ICCS/ESCCA consensus guidelines to detect GPI-deficient cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and related disorders part 2 – reagent selection and assay optimization for high-sensitivity testing. Cytometry B Clin Cytom 2018; 94: 23-48.
  4. Illingworth A et al. ICCS/ESCCA consensus guidelines to detect GPI-deficient cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and related disorders part 3 – data analysis, reporting and case studies. Cytometry B Clin Cytom 2018; 94: 49-66.
  5. Oldaker T et al. ICCS/ESCCA consensus guidelines to detect GPI-deficient cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and related disorders part 4 – assay validation and quality assurance. Cytometry B Clin Cytom 2018; 94: 67-81.
  6. Illingworth A et al. Sensitive and accurate identification of PNH clones based on ICCS/ESCCA PNH Consensus Guidelines-A summary. Int J Lab Hematol. 2019 May;41 Suppl 1:73-81. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31069981

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